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論文

Article No. K99-7
Title Association of two nuclear proteins, Npw38 and NpwBP, via the interaction
between the WW domain and a novel proline-rich motif containing glycine
and arginine.
Authors Komuro A, Saeki M, Kato S.
Journal J Biol Chem. 1999 Dec 17;274(51):36513-9.
PMID 10593949

ことの始まり


前報で、タンパク質間相互作用モチーフとして知られているWWドメインを有し、核内に存在しているNpw38という新規タンパク質について報告しました（ K99-3）。Npw38はほぼ同時に報告されたPQBP1（ Waragai et al., 1999）と同一タンパク質であり、名称としてPQBP1が採用されています。Npw38の機能を知るための方法の一つは、WWドメインに結合するタンパク質を探索し、どのようなタンパク質複合体の一員かを確かめることです。結合するタンパク質をスクリーニングする方法として最もよく使われているのは、酵母2ハイブリッド法です。そこでNpw38のWWドメインをベイトとして結合相手を探そうとしましたが、ベイトのみで転写活性を有することがわかり、この方法では結合相手を見つけることができませんでした。


経緯


次に試みたのは、大腸菌で作ったGST-Npw38をHeLa-S3細胞の核抽出物と反応させ、結合したタンパク質を精製するという方法です。その結果、分子量94kDaのタンパク質を得ることができました。このタンパク質をNpwBPと命名し、そのN末端のアミノ酸配列を決め、ESTデータベースの検索により、このタンパク質をコードするcDNAを見つけることができました。


結果


NpwBPは641アミノ酸残基からなり、2箇所にProに富む領域が見られました。これまで知られているWWドメインの結合相手はProリッチ配列なので、これら2箇所がNpw28が結合する部位であると推測しました。Npw38やNpwBPの各種欠失体を使って、プルダウンアッセイや酵母2ハイブリッド法を用いた相互作用アッセイを行い、確かにこの2箇所のProリッチ領域にNpw38が結合することが示されました。さらにオリゴペプチドをスポットした膜を用いて結合モティーフを探り、近くにArgがあるPPGPPPという配列（PGRモティーフと命名）を同定しました。


HeLa細胞内でのGFP融合Npw38の発現と抗NpwBP抗体による免疫染色の結果、核内で局在部位が一致することから、両者は核内で結合していることがわかりました。NpwBPの1番目から192番目までの領域はNpw38と同様ポリ(rG)と結合すること、さらにdGのホモポリマーである１本鎖DNAとも結合することが示されました。以上の結果から、Npw38-NpwBP複合体は核内で転写・スプライシングを行うmRNAファクトリーの構成成分として機能していることが示唆されました。


余談


NpwBPの214番目のMetから599番目のArgまでの配列は、マウスのWBP11の386アミノ酸残基と高い類似性（93%同一）を有していました。マウスWBP11はファーウエスタンスクリーニング法によってFBP21のWWドメインと結合するタンパク質として得られたものです（Bedford et al., 1998）。ただし、短縮cDNAであり、それ以上の解析はなされていません。もし、このマウスcDNAが完全長cDNAであれば、我々が得たcDNAもヒトWBP11と命名するところですが、そうではなかったのでNpwBPと命名しました。我々の論文が出た後、SH3ドメインと結合するSNP70（Craggs, 2001）やPP1と結合するSIPP1（Llorian, 2004）という遺伝子が報告されましたが、いずれもNpwBPと同一遺伝子でした。現在、この遺伝子については、WBP11という名前が採用されています。


その後、WBP11はPQBP1をはじめとする各種タンパク質と相互作用することによって、転写制御、選択的スプライシング、自然免疫などに深く関わっていることが明らかになっています。これについては別項に記載します。


本論文をJ. Biol. Chem.に投稿したところ、査読の結果修正なしで一発で受理されました。これは私にとって最初で最後の経験です。内容的には小室晃彦博士の緻密な計画に基づく実験結果なので、修正なしに受理されたことは不思議ではありません。


疑問点


Q1 複数の結合部位のうちどれが生理的意味を持つのか。


WBP11のProリッチ領域は広範囲にわたり、PQBP1のWWドメインと結合するモチーフが5箇所あります。生理的条件下では、この中のどこに結合するのか、あるいは結合する位置によってその働きに違いがあるのかなどは不明です。他にもこの部位にU5-52KのGYFドメインやFBP21の2個の直列WWドメインが結合することが報告されており、これらの結合と競合するのかどうかも興味深いです。


Q2 ポリ(rG)のみに結合することの意味。


我々はPQBP1と同様、WBP11もポリ(rG)に結合することを示しました。WBP11が神経RNA顆粒に含まれること［48］や、WBP11を精製する際RNaseによって溶出されること［12］から、WBP11はG-リッチなRNAと結合していることが示唆されます。どのようなRNAと結合して、それがどのような生理的意味を持つのかは、今後の検討課題です。


被引用文献


Google Scholarで検索した結果、被引用数は現時点（2025年）で73となっています。そのうち18報は、Npw38に関する前報（K99-3）でも引用されています。引用されている事柄の内訳を見てみると、一番多いのはPQBP1とWBP11が結合していることに関するもので30報、ついでWBP11のPGRモチーフに関するものが25報となっています。他に、WBP11とポリ(rG)との結合に関する引用［36、48］、WBP11がシロイヌナズナ［23］やカラタチ［47］の開花に関わる遺伝子ELF5と似ているという引用を行った文献があります。PQBP1とWBP11をタンパク質間相互作用のモデルとして使用し、酵母レトロトランスポゾンの組み込みのメカニズム解明［19］や新しい酵母2ハイブリッドシステムの検証［35］に用いた文献もあります。

被引用文献リスト
No. Ref ID 国 研究機関 雑誌名 論文タイトル 備考 PMID
1 R00-1 米国 Mount Sinai School of Medicine J Biol Chem. Rsp5 WW domains interact directly with the carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II. PGR motif 10781604
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16 R02-1 ドイツ
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27 R05-2 カナダ Samuel Lunenfeld Research Institute Mol Cell Biol. WW domains provide a platform for the assembly of multiprotein networks. PGR motif 16055720
28 R05-3 日本 Tokyo Medical and Dental University J Neurochem. Polyglutamine tract-binding protein-1 dysfunction induces cell death of neurons through mitochondrial stress. PQBP1:WBP11 16104847
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31 R06-2 日本 University of Tokyo Proteins Solution structure and binding specificity of FBP11/HYPA WW domain as Group-II/III. PGR motif 16463264
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